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基本信息

书名:POD-麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南

定价：128.00元

售价：87.0元,便宜41.0元,折扣67

作者:(美) H. D. 琼斯, P. R. 休理

出版社：科学出版社

出版日期：2013-11-01

ISBN：9787030390561

字数：424000

页码：

版次：1

装帧：平装

开本：12k

商品重量：0.4kg

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内容提要

转基因技术目前已成为植物遗传改良的重要手段，并在棉花、大豆、油菜、玉米等作物上成功应用，转基因作物已在部分国家大面积推广应用。《麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南》共分为五篇20章，**篇概述了麦类作物转基因研究的现状。第二篇以小麦、大麦和燕麦为例，介绍了基因枪法和农杆菌介导法的遗传转化与再生技术。第三篇涉及基因的表达与基因沉默技术。第四篇详述了转基因植株的鉴定技术，如荧光原位杂交技术、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和环境风险评估等。第五篇展望了麦类作物转基因研究的未来前景。

目录

作者介绍

文摘

序言

《POD-麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南》 引言： 在现代农业科学的浪潮中，生物技术以前所未有的力量重塑着我们对作物改良的认知与实践。其中，转基因技术作为一项颠覆性的创新，为应对全球粮食安全挑战、提升作物生产效率、改善农产品品质以及培育具有特殊功能的新品种提供了关键支撑。而麦类作物，作为全球数亿人口的主食，其基因改良的潜力与价值尤为突出。本书《POD-麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南》正是应运而生，旨在为广大从事麦类作物分子育种、基因工程、农学研究以及相关技术推广的科研人员、技术人员、研究生和高素质农民提供一本系统、详实、实用性强的实验指导手册。 本书的核心目标是整合并系统阐述当前麦类作物转基因技术在实验室操作层面的关键步骤，以及转基因作物在田间生长过程中进行鉴定和评估的科学方法。我们力求通过理论与实践相结合的方式，帮助读者建立起完整的转基因作物开发与应用知识体系，掌握核心技术要领，规避潜在风险，最终能够高效、准确地培育出具有优良性状的麦类转基因新品种，并对其进行科学的田间验证。 第一部分：转基因技术基础与策略 本部分将系统梳理麦类作物转基因研究的理论基础，为读者打下坚实的学科根基。 第一章：麦类作物基因组特性与遗传转化难题 麦类作物基因组概览： 深入介绍小麦（六倍体、四倍体、二倍体）、大麦（二倍体）等主要麦类作物的基因组结构、染色体组成、核苷酸序列特点以及基因密度分布。重点阐述多倍性对基因功能、同源染色体配对及转化效率的影响。 麦类作物遗传转化面临的挑战： 分析麦类作物相对于模式植物（如拟南芥）在遗传转化上的固有困难，包括细胞壁的致密性、组织培养的不易成功、原生质体再生效率低下、外源基因插入的不稳定性以及基因表达的调控复杂性等。 基因组学与功能基因挖掘： 介绍基因组测序技术（如高通量测序、单细胞测序）在破译麦类基因组信息中的作用，以及如何利用基因组学数据发掘与产量、抗病虫、抗逆性、品质改良等重要农艺性状相关的关键基因，为转基因育种提供靶点。 第二章：主流的麦类作物基因转化方法 农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium-mediated transformation）： 原理与技术路线： 详细解析农杆菌T-DNA转移机制，介绍常用的农杆菌菌株（如EHA105, LBA4404）、载体构建策略（如包含选择标记基因、报告基因、目的基因的T-DNA区）。 供体材料的选择与预培养： 阐述不同麦类品种、不同发育阶段的种子、胚、愈伤组织或幼苗作为供体材料的优劣势，以及高效预培养诱导愈伤组织或胚性愈伤组织的方法。 农杆菌侵染与共培养： 精细指导侵染时间、农杆菌浓度、共培养基质的选择与优化，以及如何有效降低内源微生物污染。 转化后的筛选与再生： 详述选择标记基因（如卡那霉素、草丁膦、潮霉素）在筛选转化子中的应用，不同培养基中激素配比对愈伤组织分化、芽诱导、根发生的影响，以及如何优化再生体系以提高转化效率。 不同麦类物种的转化优化策略： 针对小麦、大麦等不同物种，介绍其特有的高效转化体系，如胚性愈伤组织法、未成熟胚法、幼苗节法等。 基因枪轰击法（Biolistic transformation）： 原理与装置： 讲解金颗粒包裹DNA，通过高压气体加速轰击进入植物细胞的原理，介绍基因枪的类型、工作参数（如电压、距离、载玻片高度）的优化。 供体材料与DNA制备： 强调可用于基因枪转化的供体材料（如愈伤组织、胚、幼苗）选择，以及DNA的质量与纯度对转化效率的影响。 转化后的筛选与再生： 与农杆菌法类似，介绍选择标记基因的应用及再生体系的建立。 基因枪法在麦类作物中的应用优势与局限： 分析基因枪法在某些难以通过农杆菌法转化的麦类品种中的潜力，以及其相对较低的转化效率和基因插入的不稳定性。 其他新兴转化技术（如CRISPR/Cas9介导的基因编辑与转化）： 技术原理： 简要介绍CRISPR/Cas9系统如何在植物基因组中实现精确的基因编辑。 转化策略： 阐述如何将CRISPR/Cas9元件通过农杆菌或基因枪导入植物细胞，实现基因的敲除、敲入或修饰。 应用前景： 展望CRISPR/Cas9技术在麦类作物功能基因研究、定向育种中的重要作用。 第三章：转基因载体设计与分子构建 植物表达载体的基本组成： 启动子（Promoters）： 介绍不同类型的启动子（组成型启动子如CaMV 35S，组织特异性启动子如谷蛋白启动子，诱导型启动子，应激响应启动子）在调控外源基因表达时间与空间上的重要性，并给出麦类作物常用启动子的选择指南。 目的基因（Gene of interest）： 阐述如何选择、优化目的基因的编码区，提高其在麦类作物中的表达效率。 终止子（Terminators）： 介绍终止子的作用，以及常用终止子的选择。 选择标记基因（Selection marker genes）： 详细讲解用于筛选转化细胞或植株的标记基因，如抗生素抗性基因（KanR, HptII, SpecR）、除草剂抗性基因（Bar, ALS）等，并讨论不同标记基因的优劣。 报告基因（Reporter genes）： 介绍 GUS、GFP、YFP等报告基因在追踪转基因过程、检测基因表达水平与模式中的应用。 T-DNA边界序列（Border sequences）： 强调其在农杆菌介导转化中招募T-DNA的重要性。 基因克隆与载体构建方法： DNA提取与PCR扩增： 介绍高效提取植物基因组DNA的方法，PCR扩增目的基因片段的优化参数。 酶切连接与Gibson组装： 详细指导限制性内切酶的使用、DNA连接反应，以及Gibson组装等高效无缝克隆技术。 载体转化与筛选： 介绍将构建好的质粒转化到大肠杆菌中进行扩增，并通过抗生素筛选获得阳性克隆。 载体设计实例与考量： 提供几种典型的麦类转基因载体设计方案，并分析在设计过程中应考虑的因素，如基因拷贝数、插入位点、同源重组等。 第二部分：转基因植株的分子鉴定 成功获得潜在转基因植株后，对其进行准确的分子鉴定至关重要，本部分将聚焦于此。 第四章：转基因植株的初步筛选与验证 选择标记基因的表型检测： 抗生素筛选： 详细指导在不同生长发育阶段，通过添加特定抗生素（如卡那霉素、潮霉素）到培养基中，筛选出初步具有抗性的再生植株。 除草剂筛选： 介绍利用草甘膦、草铵膦等除草剂对幼苗进行喷雾处理，筛选出抗性植株。 溶质毒性筛选： 针对某些选择标记，介绍利用高浓度盐分或渗透胁迫进行筛选。 报告基因的活性检测： GUS活性染色： 详细指导GUS报告基因的底物（如X-Gluc）的配制、染色程序、染色结果的观察与判断，及其在早期转化子检测中的应用。 荧光蛋白检测： 介绍利用荧光显微镜或流式细胞仪检测GFP、YFP等荧光蛋白的表达，直接观察转基因表达的组织与强度。 DNA水平的鉴定： PCR鉴定（Polymerase Chain Reaction）： 设计特异性引物： 强调设计能特异性扩增目的基因、选择标记基因或T-DNA插入区域的引物。 DNA提取方法： 介绍适用于叶片、愈伤组织或幼苗等不同组织的高通量DNA提取试剂盒和手工提取方法。 PCR扩增程序优化： 指导优化PCR反应温度、时间、循环次数等参数，以获得清晰的特异性条带。 多重PCR与半定量PCR： 介绍如何通过一次PCR同时检测多个基因，或通过半定量PCR初步判断基因拷贝数。 Southern Blot杂交： 原理与流程： 详细阐述DNA提取、酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA转移（膜上）、探针制备、杂交、洗膜、显影等步骤。 应用： 强调Southern Blot在确证外源基因插入、判断基因插入拷贝数、分析基因整合方式（单拷贝、多拷贝、插入位点）等方面的“金标准”作用。 疑难解答： 针对Southern Blot中可能出现的假阴性、假阳性等问题，提供诊断与解决思路。 第五章：转基因植株的RNA与蛋白质水平验证 RNA水平的检测： RNA提取： 介绍适用于麦类作物不同组织的RNA提取方法，强调RNA的完整性与纯度。 RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）： 原理与流程： 详细说明反转录合成cDNA，再进行PCR扩增目的基因mRNA表达水平。 基因表达差异分析： 介绍与内参基因（如Actin, Tubulin）进行比较，评估目的基因的相对表达水平。 qRT-PCR（Quantitative Real-Time PCR）： 原理与优势： 讲解利用荧光染料或TaqMan探针实时监测PCR产物荧光信号，实现目的基因表达水平的精确定量。 数据分析： 指导使用ΔCt、ΔΔCt等方法进行相对定量分析。 Northern Blot杂交： 原理与应用： 介绍检测RNA分子量、判断mRNA转录本大小和表达水平的方法，与Southern Blot类似，是RNA检测的经典方法。 蛋白质水平的检测： 蛋白质提取： 介绍针对麦类作物不同组织（叶片、种子、根等）的蛋白质提取方法，以及去除蛋白酶抑制剂干扰的技巧。 Western Blot（免疫印迹）： 原理与流程： 详细阐述蛋白质提取、SDS-PAGE电泳分离、蛋白质转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影等步骤。 抗体选择与优化： 强调选择特异性强、亲和力高的抗体，并优化封闭液、一抗/二抗稀释度、孵育时间等条件。 应用： 介绍Western Blot在检测外源蛋白表达、验证蛋白翻译后修饰、分析蛋白稳定性等方面的作用。 ELISA（酶联免疫吸附测定）： 原理与优势： 介绍通过抗原抗体反应定量检测蛋白质含量的方法，适用于大规模样品检测。 应用： 针对特定性状（如产量相关蛋白、抗病蛋白、积累的次生代谢产物等）进行定量评估。 质谱分析： 简要介绍质谱技术在鉴定未知蛋白、研究蛋白质组学信息中的应用。 第三部分：转基因作物田间鉴定与风险评估 在实验室获得稳定的转基因植株后，将其引入田间进行大规模评估是验证其商业应用价值和安全性的关键。 第六章：转基因麦类作物的田间试验设计与管理 田间试验的目的与原则： 验证性状稳定性： 评估转基因性状在不同环境条件下的表现，如产量、抗性、品质等。 评估对环境的影响： 监测转基因作物对非靶标生物、土壤微生物、水体等的潜在影响。 积累生物安全性数据： 为法规审批提供科学依据。 试验地点的选择： 考虑气候、土壤、病虫害发生情况等因素，选择具有代表性的试验地点，必要时进行多点、多年试验。 试验小区设计： 隔离措施： 强调不同小区之间、转基因田块与常规田块之间的物理隔离距离，避免基因漂流（花粉传播）和生物学隔离。 重复与随机化： 介绍试验小区设计中常用的完全随机区组设计、裂区设计等，确保结果的统计学意义。 对照组设置： 设置非转基因同源系或品种作为对照，以准确评估转基因效应。 田间管理： 种植密度与播种期： 根据试验目的设定合理的种植密度和播种期。 水分、养分管理： 采用与常规栽培相似或略有差异的管理措施，以模拟实际生产环境。 病虫害防治： 避免使用对转基因性状或非靶标生物有干扰的农药，必要时进行记录。 监测与记录： 建立详细的田间试验记录表，记录生长发育进程、形态特征、病虫害发生情况、环境因子等。 第七章：转基因植株的田间表型鉴定 产量与产量构成因素评估： 产量测定： 详细指导单小区产量、单株产量、单位面积产量等的准确测定方法，考虑收获、脱粒、水分含量等因素。 产量构成因素分析： 记录穗数、穗粒数、千粒重、单株分蘖数、粒重等指标，深入分析转基因性状对产量的贡献途径。 抗逆性（抗病、抗虫、抗旱、耐盐碱等）评估： 自然接种与人工接种： 针对不同的抗性目标，介绍在田间条件下自然发生的病虫害监测，或通过人工接种病原菌、释放害虫来诱导抗性表现。 胁迫处理： 描述如何通过控制灌溉、施盐等方式，模拟干旱、盐碱等非生物胁迫环境。 抗性等级评定： 参照国家或行业标准，对植株的抗性进行分级，如抗、高抗、感、感感等。 生理生化指标测定： 结合分子鉴定，检测与抗性相关的生理指标，如抗氧化酶活性、损伤指标、叶绿素含量等。 品质性状评估： 籽粒成分分析： 测定蛋白质含量、淀粉含量、脂肪含量、维生素、微量元素等，并与对照组进行比较。 加工品质评估： 针对特定品种，如用于酿造的大麦，评估其发芽率、淀粉酶活性；用于制粉的小麦，评估其面筋含量、面团流变学特性等。 感官评价： 在必要时，进行烹饪或加工后的口感、风味等感官评价。 形态学与生长发育监测： 生育期测定： 记录从播种到成熟的各个生育期（如出苗期、拔节期、抽穗期、灌浆期、成熟期）。 株高、分蘖数、叶片特征等： 定期测量株高、茎秆粗细、叶片大小、颜色等，观察是否有异常。 第八章：转基因作物潜在风险评估与生物安全性 基因水平转移（Gene Flow）的监测与评估： 花粉传播监测： 采用分子标记方法（如PCR、SSR标记）检测周围非转基因田块中是否存在转基因花粉或种子。 种子传播监测： 关注转基因种子在田间或自然环境中的扩散情况。 评估基因漂流对基因库的影响。 对非靶标生物的影响评估： 授粉昆虫（蜜蜂、蝴蝶）： 监测转基因作物花粉对授粉昆虫的存活、繁殖能力的影响。 土壤微生物： 分析转基因植株根系分泌物或植株残体对土壤微生物多样性、活性及其代谢途径的影响。 其他有益生物： 关注天敌昆虫、蚯蚓等对转基因作物的反应。 潜在的过敏原性与毒性评估： 过敏原数据库比对： 检查引入的目的基因是否与已知的过敏原蛋白序列相似。 动物毒性试验（必要时）： 委托专业机构进行动物喂养试验，评估转基因作物的长期食用安全性。 基因沉默与表达不稳定性： 多代系代追踪： 监测转基因性状在连续几代的遗传稳定性，排除由于基因沉默导致的性状衰退。 基因拷贝数与插入位点分析： 关联基因拷贝数、插入位点与性状表达的稳定性。 环境释放前的法规要求与审批流程： 介绍不同国家和地区关于转基因作物田间试验和商业化生产的法律法规。 申请材料的准备要点。 风险评估报告的编写。 结论： 《POD-麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南》是一本集理论深度、操作细节与实践指导于一体的专业书籍。本书旨在系统地梳理麦类作物转基因技术的整个流程，从实验室的载体构建、高效转化，到分子水平的精确鉴定，再到田间的多重性状评估与风险考量。我们深信，通过对本书内容的学习与实践，读者不仅能够掌握麦类作物转基因技术的核心技能，更能理解其在保障粮食安全、提升农业生产力中的重要意义。同时，本书也强调了科学、负责任地进行转基因研究的重要性，引导研究者在追求技术创新的同时，充分评估并管理潜在风险，为我国乃至全球的农业可持续发展贡献力量。 本书的编写始终秉持着严谨、实用、前沿的原则，力求为广大科研工作者提供最可靠的技术指导和理论参考。希望本书能够成为您在麦类作物转基因技术研究与应用道路上的得力助手。