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[美] J.E.科林根等著，李慎濤等譯

圖書標籤:

蛋白質科學
生物化學
實驗指南
分子生物學
蛋白質錶達
蛋白質純化
蛋白質結構
生物技術
實驗室操作
科研方法

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齣版社：科學齣版社

ISBN：9787030180865

版次：1

商品編碼：12109514

包裝：平裝

叢書名：生命科學實驗指南係列

開本：16開

齣版時間：2007-01-01

用紙：膠版紙

頁數：752

字數：1114000

正文語種：中文

具體描述

內容簡介

　　《精編蛋白質科學實驗指南》內容全部取材於該書和每季度更新的服務手冊，其詳細提供瞭多種實驗方案，並包含實驗材料、步驟和每種技術的參考文獻等信息，可使有經驗的研究人員將其作為獨立的實驗室指南來使用。
　　由於蛋白質具有多樣性，其分析也必須包括很廣範的結構和理化方法，因此每個研究人員都必須盡可能多地掌握新方法和傳統方法。本指南中既包括特定的詳細方案，也包括使方法適應手頭特定項目的策略，相信能夠有助於讀者進一步深入進行蛋白質科學和相關領域的研究。

內頁插圖

譯者的話
前言
參編者
推薦的背景讀物

第1章蛋白質純化和定性的策略
1．1 單元蛋白質純化和定性概述
目標和研究對象
蛋白質純化的原料
蛋白質的檢測和分析
蛋白質分離和純化方法
蛋白質産物的定性
蛋白質純化實驗室
1．2 單元蛋白質純化流程圖
可溶性重組蛋白
不可溶性重組蛋白
可溶性非重組蛋白
膜相關的和不可溶性重組蛋白

第2章計算分析
2．1 單元用於蛋白質序列分析的疏水分布圖
方法學
應用
結論
2．2 單元蛋白質二級結構預測
二級結構預測的方法
二級結構預測方法的應用
2．3 單元使用BLAST程序傢族進行序列相似性搜索
進入BLAST程序和文檔
BLAST介紹
BLAST程序
2．4 單元因特網上的蛋白質數據庫
蛋白質結構數據庫
蛋白質傢族數據庫
2．5 單元蛋白質三級結構預測
同源性建模
序列分布圖法
綫程法
從頭結構預測
2．6 單元蛋白質三級結構建模
詞匯
進入SwissModel程序和文檔
ExPDB數據庫
創建首次法建模查詢的格式
觀看SwissModel結果
2．7 單元比較蛋白質結構預測
比較建模的步驟

第3章檢測和分析方法
3．1 單元分光光度法確定蛋白質濃度
基本方案1 計算一個蛋白質的摩爾吸收係數
基本方案2 摺疊蛋白質摩爾吸收係數的測定
基本方案3 使用摩爾吸收係數通過吸收光譜測定蛋白質的濃度
基本方案4 通過205nm處的吸收光譜測定蛋白質的濃度
基本方案5 粗蛋白質提取液總蛋白質濃度的測定
3．2 單元定量氨基酸分析
樣品製備
平均組成的計算
3．3 單元肽和蛋白質的體外放射標記
基本方案1 使用碘珠對酪氨酸或組氨酸殘基進行碘化
備擇方案1 用氯胺T或Iodogen在酪氨酸或組氨酸殘基碘化
備擇方案2 使用乳酸過氧化物酶在酪氨酸或組氨酸殘基碘化
輔助方案1 等摩爾碘化以獲得産物的高收率
輔助方案2 用HPLC從碘化産物中分離未標記的肽
基本方案2 用Bolton-Hunter試劑在賴氨酸殘基或N端碘化
基本方案3 通過酸酐乙酰化在賴氨酸殘基或N端進行14C或3H標記
備擇方案3 通過還原性烷基化在賴氨酸殘基或N端進行14C或3H標記
備擇方案4 用碘乙酸或碘乙酰胺在賴氨酸殘基進行14C或3H標記
基本方案4 在肽閤成過程中引入標記的氨基酸殘基
備擇方案5 在肽閤成過程中在N端進行選擇性標記
3．4 單元總蛋白質的分析
基本方案1 總蛋白質定量的雙縮脲分析
基本方案2 總蛋白質定量的Hartree-Lowry分析
基本方案3 總蛋白質定量的二喹啉甲酸（BCA）分析
基本方案4 總蛋白質定量的酸消化——茚三酮法
輔助方案1 熱封玻璃管
基本方案5 測量總蛋白質的考馬斯染料結閤分析（Bradford分析）
輔助方案2 蛋白質樣品的凝膠透析
……
第4章提取、穩定和濃縮
第5章重組蛋白的生産
第6章重組蛋白的純化
第7章重組蛋白的定性
第8章常規層析分離
第9章親和層析
第10章電泳
第11章化學分析
第12章翻譯後修飾：糖基化
第13章翻譯後修飾：磷酸化和磷酸酶
第14章翻譯後修飾：特定的應用
第15章蛋白質的化學修飾
第16章質譜
第17章肽的製備和處理
第18章蛋白質互相作用的鑒定
第19章蛋白質相互作用的定量
第20章肽酶
第21章基於凝膠的蛋白質組分析
附錄1 試劑和溶液
附錄2 常用的度量製和數據
附錄3 常用技術
附錄4 試劑和設備供貨商
參考文獻
索引

前言/序言

　　蛋白質像人一樣，很有個性，但又有很多共同點。結構特點很相似的蛋白質，其物理特性會截然不同，這種異質性會給有誌於研究蛋白質結構和功能的科學傢提齣很大挑戰，因為我們不能夠根據蛋白質的序列和結構來預測其生物學和物理功能，例如，已知一種蛋白質的三級結構，我們不能夠準確地預測如何對其進行結晶和純化。因此，盡管隨著生物信息學能力的日益增強，我們能夠使這一過程更加閤理，但蛋白質化學的許多方麵還要靠經驗的方法。隨著分子生物學、遺傳學、結構生物學和相關學科的發展，蛋白質科學也正在不斷地復興，對有關蛋白質方法的參考資料的需求也不斷增長。使用重組的方法，現在能夠過量錶達正常形式和重新設計形式的蛋白質，並能夠創造具有獨特新特性的嵌閤蛋白質。錶達有親和標簽的蛋白質特彆有助於蛋白質的純化。高水平地錶達那些在通常情況下低豐度的蛋白質以及對其氨基酸序列進行操作，這種能力為研究蛋白質的排列和其相關的生物學過程（體外和體內兩種情況下）提供瞭空前的機會。蛋白質的生物化學、生物物理和高分辨率結構分析與相關基因的操作（在培養的細胞或整個哺乳動物中）組閤在一起已在生物技術和分子醫學的許多領域取得瞭驚人的進展。
　　由於蛋白質具有這樣的多樣性，其分析也必須包括很廣範的結構和理化方法，每個研究人員的方法庫中必須都包括新方法和老方法（傳統方法），而且，適閤於純化和初步定性與目的生物學活性有關的蛋白質的方法，通常並不適閤於分析相應的過量錶達的重組蛋白。本指南中既包括特定的詳細方案，也包括使方法適應手頭特定項目的策略，是為那些幾乎沒有蛋白質分離和定性經驗的科學工作者而設計的，可能是研究生和在其他生物學科受過訓練的科學工作者。同時，本書中介紹的大量技術可以保證即使是經驗豐富的專傢也會找到新的有用的方法，而且會受益於本書中便捷的標準信息和方法的編排方式，通常情況下，這些標準信息和方法必須要從許多資料中精選。
　　盡管掌握瞭本書介紹的技術能夠使讀者進行蛋白質科學和相關領域的研究，但是，無論是本書還是CPPS都不適於替代研究生的蛋白質科學課程，也不適於作為本領域的綜閤教材。此外，我們強烈建議讀者與更有經驗的研究人員一起在實驗室中得到第一手的經驗。

圖書簡介：分子生物學核心技術與前沿應用本書涵蓋範圍：本書旨在為生命科學領域的研究人員、高級本科生及研究生提供一套全麵、深入且緊貼當前科研熱點的分子生物學核心實驗技術指南。內容側重於基因剋隆與錶達調控、蛋白質結構與功能分析、細胞信號轉導通路解析以及新型生物技術工具的應用，力求在理論闡述與實際操作之間搭建堅實的橋梁。 --- 第一部分：分子剋隆與基因組操作的精進本部分詳細剖析瞭現代分子生物學實驗的基石——基因的獲取、修飾與穩定錶達。我們摒棄瞭對基礎PCR原理的冗長描述，轉而聚焦於提升實驗成功率和解決復雜問題的策略。第一章：高保真擴增與復雜模闆的應對本章深入探討瞭聚閤酶鏈式反應（PCR）在應對極端GC含量、復雜二級結構或低拷貝數模闆時的優化方案。內容包括：熱啓動酶的選擇與濃度梯度優化：如何根據模闆特性篩選最佳的DNA聚閤酶，並精確控製鎂離子濃度與循環參數。非經典PCR技術應用：重點介紹基於長模闆（Long-Range PCR）和高通量文庫製備的前期擴增策略。錯誤修正與突變檢測：探討利用Proofreading酶進行高保真擴增的質量控製，並詳細介紹基於Sanger測序和高通量測序驗證突變位點的標準化流程。第二章：重組DNA載體的構建與文庫的構建本章聚焦於高效、定嚮地將目標基因插入錶達載體。酶切連接技術的精細化管理：討論限製性內切酶的活性檢測、保護性封阻（Star Activity）的規避，以及高效的DNA連接酶反應條件（ATP濃度、溫度和時間軸控製）。無縫剋隆技術（Seamless Cloning）：詳盡對比Gibson Assembly、SLIC及其他基於同源重組的剋隆方法的操作要點、適用範圍及其在多片段組裝中的優勢。基因組與cDNA文庫的構建：側重於如何選擇閤適的載體（噬菌體、質粒或人工染色體載體），以及針對特定研究目的（如小RNA測序或全基因組重測序）的DNA片段化與接頭連接策略。第三章：基因編輯技術：CRISPR/Cas係統的實踐應用本章將CRISPR/Cas係統從理論引入到精準的實驗室操作層麵。 sgRNA的設計與驗證：介紹多種生物信息學工具對脫靶效應的預測，以及體外（in vitro）的切割活性檢測方法。遞送策略的選擇與優化：詳細對比脂質納米粒（LNP）、電穿孔法以及AAV載體介導的Cas9/sgRNA遞送在不同細胞係中的效率與安全性評估。基因敲入與敲除的後篩選：闡述利用T7 Endonuclease I assay、高分辨熔解麯綫分析（HRM）以及單剋隆篩選技術，對編輯效率進行量化分析。 --- 第二部分：蛋白質的錶達、純化與高級結構解析理解蛋白質的功能，必須首先獲得高純度和高活性的目標分子。本部分側重於優化蛋白質的生産流程和利用先進技術探究其三維結構。第四章：重組蛋白的異源錶達與優化策略本章探討瞭在原核（大腸杆菌）、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞係統中錶達外源性蛋白質的挑戰與解決方案。大腸杆菌錶達體係的陷阱：深入分析包涵體形成的原因，以及通過低溫誘導、共錶達伴侶蛋白（Chaperones）或優化培養基策略來提高可溶性錶達的方案。真核錶達係統的選擇：比較CHO、HEK293等細胞係在糖基化模式、錶達水平和啓動子選擇上的差異性，特彆關注抗體和重組因子生産的工藝考量。可溶性標簽（Soluble Tags）的選用與去除：評估GST、His-tag、SUMO等標簽對目標蛋白摺疊、溶解度和後續純化的影響，並提供高效的酶切或自裂解策略。第五章：多級分離純化技術與質量控製純化不僅是去除雜質，更是保持蛋白質天然構象的關鍵步驟。親和層析的高級應用：不僅限於IMAC（金屬離子親和層析），更深入討論瞭通過特異性配體（如蛋白A/G或Streptavidin）實現的捕獲層析的優化。疏水作用層析（HIC）與離子交換層析（IEC）：探討利用pH梯度和鹽梯度分離具有相似等電點（pI）的蛋白亞群，以及應對層析柱失活和樣品吸附問題的技巧。製備型色譜與超濾/滲濾（UF/DF）：介紹高分辨率製備型HPLC在最終精純中的應用，以及利用切嚮流過濾技術進行快速緩衝液置換和濃縮的標準操作規程。第六章：蛋白質結構與相互作用的體外解析本章聚焦於利用結構生物學工具驗證蛋白質的功能狀態。 X射綫晶體學與冷凍電鏡（Cryo-EM）的準備工作：詳細闡述高純度、高穩定性的蛋白質樣品對於成功獲取高質量衍射數據的重要性，包括小分子添加劑篩選和晶體生長條件的優化。錶麵等離子共振（SPR）與生物層乾涉測量（BLI）：深入解析定量測定分子間結閤動力學（$k_{on}, k_{off}$）和親和力（$K_D$）的實驗設計，包括配體固定化效率和基綫漂移的校正。氫-氘交換質譜（HDX-MS）：作為探究蛋白質動態變化的利器，本章介紹如何利用HDX-MS來映射構象變化和藥物結閤位點。 --- 第三部分：細胞信號轉導與功能性分析本部分轉嚮細胞水平，探討如何利用現代技術來追蹤和量化細胞內的分子事件。第七章：免疫學檢測技術的深度應用本章超越基礎Western Blot，專注於定量和高通量免疫檢測。定量蛋白質組學基礎：介紹基於抗體標記的ELISA和Luminex多重分析的實驗設計，重點在於標準麯綫的綫性範圍確證與批間差異的控製。免疫熒光與共聚焦顯微成像：討論熒光淬滅（FRET）和光漂白（FRAP）等高級成像技術，用於分析細胞內蛋白的空間定位和動態遷移。流式細胞術與細胞分選（FACS）：詳細介紹多參數熒光補償矩陣的建立、細胞周期的同步化處理，以及活細胞分選後的下遊應用。第八章：細胞信號通路的解析與藥物篩選本章關注對動態信號轉導網絡的實時監測。激酶活性檢測：介紹基於底物肽段的放射性或熒光標記檢測方法，以及利用磷酸化特異性抗體進行Western Blot驗證的流程。報告基因係統的構建與應用：詳述如何利用啓動子驅動的熒光蛋白或熒光素酶報告基因係統，來檢測特定轉錄因子激活或信號通路（如NF-$kappa$B, Wnt）的活性變化。高內涵篩選（HCS）的實驗設計：探討在藥物發現過程中，如何利用自動顯微成像平颱對細胞錶型進行多維度、高通量的量化分析。 --- 附錄：實驗室安全與數據管理規範本書最後附有關於生物安全等級（BSL）的最新規範、生物廢棄物的分類處理標準，以及遵循FAIR原則的數據存儲與備份策略，確保實驗操作的閤規性與數據的可追溯性。本書的特色在於其“問題導嚮”和“技術整閤”的視角。它不追求覆蓋所有基礎知識的廣度，而是深入鑽研當前科研瓶頸處所需的高級技術細節，是追求實驗精確性和創新性的研究者不可或缺的參考手冊。

用戶評價

评分 ☆☆☆☆☆

在學習和研究蛋白質功能的過程中，蛋白質結構和互作的分析是必不可少的一環。這本書在這些方麵的講解，可以說是非常係統且深入的。我之前在文獻中看到過一些關於蛋白質晶體學、NMR或者冷凍電鏡的內容，但總覺得有些遙不可及，不知道如何下手。這本書則將這些復雜的概念進行瞭很好的梳理和解釋，讓我能夠對其有一個初步但清晰的認識。例如，在介紹蛋白質結晶時，它不僅講解瞭結晶的原理，還詳細列舉瞭影響結晶的各種因素，比如蛋白質的純度、濃度、緩衝液成分，以及各種添加劑的作用。更重要的是，它還提供瞭一些實際操作中的技巧，比如如何選擇閤適的起始點，如何進行“滴定”實驗來優化結晶條件，甚至還分享瞭一些解決常見結晶問題的經驗。同樣，在講解蛋白質互作分析時，它也涵蓋瞭 Yeast two-hybrid、Co-immunoprecipitation (Co-IP)、Surface Plasmon Resonance (SPR) 等多種方法，並對每種方法的原理、實驗步驟、優缺點以及適用範圍進行瞭詳細的比較和說明。這讓我能夠根據自己的研究目的，選擇最適閤的實驗技術來研究蛋白質之間的相互作用，從而更全麵地揭示蛋白質的功能網絡。

评分 ☆☆☆☆☆

說實話，我一直對某些實驗操作細節感到很睏惑，比如在western blot實驗中，明明按照文獻上的步驟操作瞭，但信號總是很弱，或者背景很高，搞得我心力交瘁。這本書在這方麵簡直是我的救星！它對western blot的整個流程進行瞭非常細緻的講解，不僅包括瞭電泳、轉膜、封閉、一抗二抗孵育、顯色這些大步驟，更深入到瞭每一個小環節。例如，在電泳部分，它會詳細說明不同百分比的膠如何影響蛋白質的分離效果，以及如何根據你的目標蛋白分子量來選擇最閤適的膠濃度。對於轉膜，它會對比不同轉膜方式（半乾式、濕轉）的優缺點，以及不同轉膜緩衝液的配製要點和影響。最讓我驚喜的是，書中專門用瞭一個章節來講解“實驗結果分析與故障排除”，裏麵列舉瞭許多常見的實驗問題，並給齣瞭非常具體的解決方案。比如，信號弱可能是什麼原因，如何優化抗體濃度、孵育時間；背景高又該怎麼辦，是封閉不充分，還是洗滌步驟有問題？它甚至還提到瞭如何選擇閤適的顯色底物以及不同顯色方法的原理，這讓我對整個顯色過程有瞭更清晰的認識。這本書讓我感覺，我不是在機械地執行一個步驟，而是真正理解瞭每一個操作背後的科學道理，這樣在遇到問題時，我不再是束手無策，而是能夠根據原理進行有針對性的調整，大大提高瞭實驗的成功率。

评分 ☆☆☆☆☆

拿到這本《精編蛋白質科學實驗指南》的時候，我真的是迫不及待地想 dive in 瞭，尤其是看到封麵設計得這麼專業，厚度也正是我需要的——既有深度又不至於讓人望而卻步。作為一個剛起步不久的博士生，之前在文獻裏看到的各種實驗方法，雖然覺得都很酷炫，但實際操作起來總是感覺抓不住重點，或者不知道該如何優化。這本書在這方麵就做得相當到位，它不像某些教科書那樣乾巴巴地列齣步驟，而是花瞭大量的篇幅去講解“為什麼”要這樣做，以及每一步背後的原理是什麼。比如，在介紹蛋白質純化部分，它不僅僅是告訴你 A 步驟加什麼，B 步驟怎麼洗脫，而是詳細解釋瞭不同純化介質的原理，各種緩衝液成分對蛋白質穩定性的影響，甚至還提到瞭不同蛋白質的等電點和疏水性如何影響選擇閤適的純化方法。這一點對我來說尤其重要，因為我目前的研究方嚮涉及一些比較棘手的重組蛋白錶達，之前嘗試瞭幾種方法都效果不佳，但看瞭這本書的分析後，我纔意識到可能是緩衝液的 pH 選擇不對，或者親和層析的配體不匹配。書中還穿插瞭大量的小貼士和“注意事項”，這些往往是我們在網上搜尋教程或者從師兄師姐那裏口口相傳纔能獲得的信息，但這本書把它係統地整理瞭齣來，而且很多內容是基於實際操作經驗的總結，非常實用，能幫我們少走不少彎路。

评分 ☆☆☆☆☆

作為一個在實驗室摸爬滾打多年的老兵，我深知實驗技術的熟練掌握和不斷更新的重要性。這本書最讓我感到欣慰的一點是，它並沒有局限於介紹一些“經典”的實驗方法，而是涵蓋瞭許多當下非常熱門和前沿的蛋白質研究技術。例如，在基因編輯和蛋白質錶達方麵，它就介紹瞭一些利用CRISPR/Cas9技術進行基因敲除或敲入，以及利用各種錶達係統（如大腸杆菌、酵母、哺乳動物細胞）來獲得高效高産重組蛋白的方法。在蛋白質功能研究方麵，它還涉及瞭光遺傳學、化學誘餌等新興技術，這些技術為我們深入探究蛋白質在細胞內的動態調控和復雜功能提供瞭新的視角和強大的工具。而且，這本書的講解方式非常注重實踐性，它提供的實驗方案大多是經過優化和驗證的，能夠直接應用於科研實踐，大大縮短瞭我們摸索和學習新技術的周期。對我來說，這意味著我能夠更快地將最新的研究思路轉化為可行的實驗方案，從而在科研領域保持競爭力，並取得突破性的進展。總而言之，這本書就像是一位經驗豐富、與時俱進的實驗室導師，它不僅教會我“怎麼做”，更引導我“為什麼這麼做”，並不斷給我注入新的知識和靈感。

评分 ☆☆☆☆☆

作為一名正在撰寫畢業論文的研究生，對實驗結果的準確性和可重復性有著極高的要求。這本書在這方麵給我提供瞭非常寶貴的指導。我尤其欣賞的是它在介紹各種實驗技術時，不僅僅是簡單地描述操作流程，而是非常注重實驗設計和數據分析的嚴謹性。比如，在介紹酶活性測定時，書中花瞭很大的篇幅講解瞭如何進行動力學參數的測定，包括不同底物濃度下的反應速率，如何選擇閤適的起始反應時間，以及如何通過Lineweaver-Burk圖或Hanes-Woolf圖來擬閤數據，計算Km和Vmax。這些內容對於理解酶的作用機製以及在論文中進行深入的討論至關重要。此外，書中還特彆強調瞭對照實驗的重要性，以及如何設計有效的對照來排除非特異性結閤或者其他乾擾因素的影響。這對於我們確保實驗結果的可靠性，避免在數據解讀上齣現偏差非常有幫助。而且，書中還提供瞭許多關於數據可視化和統計分析的建議，比如如何選擇閤適的圖錶類型來展示你的數據，以及在必要時如何進行統計學檢驗來證明你的結果是否具有顯著性。這些內容對於提升論文的科學性和嚴謹性，讓你的研究成果更有說服力，起到瞭不可替代的作用。

評分 ☆☆☆☆☆

內容詳細，豐富。

評分 ☆☆☆☆☆

生物技術的教科書

評分 ☆☆☆☆☆

生命科學實驗指南係列：精編分子生物學實驗指南（第5版套裝上下冊）

評分 ☆☆☆☆☆

生命科學必備！！非常好的書！！！贊！！

評分 ☆☆☆☆☆

挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友！挺好的朋友！挺好的朋友！挺好的朋友！挺好的朋友！挺好的朋友！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！挺好的朋友們！

評分 ☆☆☆☆☆

東西還不錯，很好看！